Kit de imunoensaio enzimático competitivo para Análise quantitativa da Tiamulina
1. Antecedentes A Tiamulina é uma droga antibiótica pleuroputilin que é utilizada em medicina veterinária, especialmente para suínos e aves. Tem sido estabelecido um LMR rigoroso devido ao potencial efeito colateral no ser humano. A HPLC ou LC-MS é a abordagem comum para detectar a tiamulina e é limitada pelas elevadas despesas e custos no pré-tratamento da amostra. O ELISA é rápido e preciso, podendo ser utilizado para a detecção de resíduos de tiamulina em amostras musculares. 2. Princípio do ensaio Este kit baseia-se na tecnologia ELISA indirecta. Os poços de microtitulação são revestidos com antigénio de acoplamento. O resíduo de Tiamulina na amostra compete com o antigénio revestido na placa de microtitulação para o anticorpo. Após a adição de anti-anticorpo marcado com enzima, o substrato TMB é utilizado para mostrar a cor. A absorvância da amostra está negativamente relacionada com a tiamulina reside nela, após comparação com a curva padrão, multiplicada pelo factor de diluição, pode ser calculada a quantidade de resíduos de tiamulina na amostra. 3. Aplicações Este kit destina-se à análise quantitativa de resíduos de tiamulina em tecidos animais (carne de porco e de frango, etc.). 4. Reacções cruzadas Tiamulina ........................... … 100% Lincomicina … ..................... … ..... < 0.1% Espectinomicina ................... … ..... < 0.1% Apramicina .................... … ..... < 0.1% 5. Materiais necessários 5.1 Equipamento ---- espectrofotómetro de placa de microtitulação (450 nm/630 nm) ---- evaporador rotativo / aparelho de secagem de nitrogênio ---- homogeneizador ---- Shaker ---- misturador Vortex ---- centrífuga ---- balança analítica (indutância: 0,01g) -----pipeta graduada: 10 ml ---- bolbo de borracha para pipetas ---- balão volumétrico: 100 ml, 500 ml, 1 L. ---- tubo de ensaio de vidro: 10ml ---- tubo de centrífuga de poliestireno: 2 ml, 10 ml, 50 ml ---- tubo de centrífuga de vidro: 10 ml ---- micropipetas: 20μl-200μl, 200μl-1000μl 250 ul - multipipeta 5.2 reagentes ---- acetato de etilo (ar) ----dimetilformamida (DMF, ar) ---- água desionizada 6. Componentes do kit
Placa de microtitulação com 96 poços revestidos com antigénio
Concentrado de soluções padrão (6 frascos × 1 ml/frasco)
0ppb, 3ppb, 9ppb, 27ppb, 81ppb, 243ppb
Solução padrão de pontas: 1 ppm (1 ml/frasco)
Conjugado enzimático de 7 ml... …......... …. Tampa vermelha
Solução de anticorpo de 7 ml......... ….. … tampa verde
Solução de substrato A 7 ml...........tampa branca
Solução de substrato B 7 ml .......... … tampa vermelha
Parar a solução 7 ml............…... tampa amarela
solução de lavagem concentrada a 20 × , 40 ml
......................... tampa transparente
2 × solução de extracção 50 ml ........ ….. … tampa azul
7. Preparação dos reagentes Solução 1: Solução de extracção Diluir 2 × de solução de extracção concentrada com água desionizada na relação de volume de 1:1, que será utilizada para a extracção da amostra. Esta solução pode ser armazenada por 1 mês em 4ºC. Solução 2: Diluente de amostra Misturar a solução de extracção com DMF na relação de volume de 22:3. Misture completamente para utilização. Solução 3: Solução padrão Diluir o concentrado da solução-padrão com a solução de extracção (solução 1) na relação de volume de solução-padrão de 1:9 (solução-padrão de 50 UL, solução de extracção de 450 UL). Esta solução-padrão diluída pode ser conservada durante 2 h a 20 25ºC. Solução 4: Solução de lavagem Diluir a solução de lavagem concentrada 20 x com água desionizada na proporção de volume de 1:19, que será utilizada para lavar a placa. A solução de lavagem diluída pode ser conservada durante um mês a 4ºC C. 8. Preparações para amostras 8.1 Aviso e precauções antes da operação (A) Utilize pontas one-off no processo de experiência e altere as pontas quando absorver diferentes reagentes. B) certificar-se de que todas as ferramentas experimentais estão limpas. 8.1 tecidos animais (carne de porco, frango, etc.) ---- pesar 2.0 ± 0,05 g de amostra de tecido homogeneizado num tubo de centrífuga de poliestireno de 50 ml e adicionar 8 ml de acetato de etilo, agitar ferozmente durante 10 min e, em seguida, centrifugar durante 5 min, a 20 25ºC, a 3000 g. ---- Transferir 1 ml do líquido sobrenadante transparente para um tubo de vidro limpo de 10 ml, secar com um fluxo de azoto a 50 60ºC. ---- dissolver o resíduo seco com 1 ml de diluente de amostra (solução 2), vórtice durante 1 min (a amostra pode ser turva, não influenciando o resultado). ----- tomar 50μl da solução preparada para ensaio.
Factor de diluição .................... 4
9. Processo de ensaio 9.1 Aviso antes do ensaio 9.1.1 Certifique-se de que todos os reagentes e micropoços estão todos à temperatura ambiente (20 25ºC). 9.1.2 devolver todos os reagentes restantes a 2-8ºC imediatamente após a utilização. 9.1.3 Lavar os micropoços corretamente é um passo importante no processo de ensaio; é o fator vital para a reprodutibilidade da análise ELISA. 9.1.4 evitar a luz e cobrir os micropoços durante a incubação. 9.2 passos do ensaio 9.2.1 retirar todos os reagentes à temperatura ambiente (20-25ºC C) durante mais de 30 min, agitar suavemente antes de utilizar. 9.2.2 retire os micropoços necessários e volte o resto para o saco com fecho de correr a 2-8ºC imediatamente. 9.2.3 número: Numere cada posição do micropoço e todos os padrões e amostras devem ser executados em duplicata. Registe as posições das normas e das amostras. 9.2.4 Adicionar solução padrão/amostra /conjugado enzimático/anticorpo: Adicionar 50µL de solução padrão (solução 3)/ amostra aos poços correspondentes, adicionar 50µL de conjugado enzimático (componente kit), 50µL de anticorpo (componente kit), agitar suavemente para misturar completamente. E, em seguida, incubar a 37ºC C durante 30 min com a tampa. 9.2.5 Lavar: Retirar a tampa suavemente e deitar o líquido dos poços e lavar os micropoços com 250µl de solução de lavagem diluída (solução 4) a intervalos de 10 s durante 4-5 vezes. Absorver a água residual com papel absorvente. 9.2.6 coloração: Adicionar 50µL da solução A (componente do kit) e 50µL da solução B (componente do kit) a cada poço. Misturar cuidadosamente agitando a placa manualmente e incubar durante 15 minutos a 37ºC C com a tampa (ver 12.8). 9.2.9 medida: Adicionar 50µL da solução de paragem (componente do kit) a cada poço. Misture suavemente agitando a placa manualmente e meça a absorvância a 450 nm (recomenda-se a medição com comprimento de onda duplo de 450/630 nm. Leia o resultado no espaço de 5 minutos após adicionar a solução de paragem) 10. Resultados Absorvância de 10.1 % Os valores médios dos valores de absorvância obtidos para os padrões e as amostras são divididos pelo valor de absorvância do primeiro padrão (padrão zero) e multiplicados por 100 %. O padrão zero é assim tornado igual a 100 % e os valores de absorvância são indicados em percentagens. Não Padrão de absorvância B (ou amostra) B0 -- padrão zero de absorvância 10.2 curva padrão Para traçar uma curva-padrão: Tomar como eixo x o valor de absorvância dos padrões, semilogarítmico, da concentração da solução-padrão de tiamulina (ppb). A concentração de tiamulina de cada amostra (ppb), que pode ser lida a partir da curva de calibração, é multiplicada pelo factor de diluição correspondente de cada amostra seguida e obtém-se a concentração real da amostra. Aviso: Foi desenvolvido um software especial para toda a interpretação de dados, que pode ser fornecido a pedido. 11. Sensibilidade, precisão e precisão Sensibilidade de teste: 0,3 ppb Limite de detecção: Tecido ......... …... … ....................................... 2 ppb Precisão: Tecido .................................... … 80 ± 15% Precisão: O coeficiente de variação do kit ELISA é inferior a 10%. 12. Aviso 12.1 os valores médios dos valores de absorvância obtidos para os padrões e as amostras serão reduzidos se os reagentes e as amostras não tiverem sido regulados para a temperatura ambiente (20 25ºC). 12.2 não deixe que os micropoços sequem entre os passos para evitar a repetição sem sucesso e opere o passo seguinte imediatamente após ter passado o suporte dos micropoços. 12.3 agitar cada reagente cuidadosamente antes de o utilizar. 12.4 mantenha a sua pele afastada da solução de paragem, pois é a solução H2SO4 de 0,5 M. 12.5 não utilize os kits desactualizados. Não troque os reagentes de lotes diferentes, pois irá diminuir a sensibilidade. 12.6 mantenha os kits ELISA a 2-8ºC, não congele. Vedar as placas de micropoços de apoio evita a exposição solar direta durante todas as incubações. Recomenda-se a cobertura das placas de microtitulação para a amostra padrão e o reagente cromogénico incolor é sensível à luz. 12.7 a solução de substrato deve ser abandonada se virar as cores. Os reagentes podem apresentar um mau sinal se o valor de absorvância (450/630 nm) do padrão zero for inferior a 0.5 (A450nm < 0.5). A reação de coloração necessita de 15 minutos após a adição da solução A e da solução B. e pode prolongar os intervalos de tempo de incubação para 20 minutos ou mais se a cor for demasiado clara para determinar. 12.8 Nunca exceda 25 min., pelo contrário, reduza o tempo de incubação correctamente. 12.9 a temperatura de reacção ideal é de 37ºC C. Uma temperatura mais elevada ou mais baixa irá provocar alterações nos valores de sensibilidade e absorvância. 13. Armazenagem Condição de armazenamento: 2-8ºC. Período de armazenamento: 12 meses
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